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| Física | Trabajo Práctico: Espectrofotometría I | 2006 | Altillo.com |
ESPECTROFOTOMETRÍA 1
OBJETIVO:
Controlar y asegurar el buen funcionamiento de un espectrofotómetro.
FUNDAMENTO:
Control de cubetas: Asegura que la variación de las cualidades ópticas de dos cubetas no difieran en más de un 1%.
Control de luz espúrea: Determina la presencia de luz que llega al detector sin haber atravesado la solución cuya absorbancia queremos medir. Para que la lectura sea válida el porcentaje de luz espírea debe ser menor al 1%.
Control de volumen mínimo: Asegura que toda la luz pase por la solución.
Control de centro de banda: Indica la correlación entre la longitud de onda leída en el selector y la real. Asegura la lectura de la correcta longitud de onda donde se encuentra el maximo de absorción del cromógeno, evitando la pérdida de sensibilidad.
Control de linealidad fotométrica: Indica si el espectrofotómetro responde linealmente a la ley de Lambert-Beer.
MATERIALES:
·
Espectrofotómetro Jenway 6300 Nº12·
Espectrofotómetro Bauschg Lomb Nº1·
Tubos de vidrio·
Tubo Negro·
Cubetas plásticas·
Cubeta pintada de negro·
Solución de Rojo Congo 300 mg/ l, diluída 1/5 con agua·
Pipetas de 1 y 10 ml
ESPECTROFOTÓMETRO JENWAY 6300
1- CONTROL DE CUBAS Y CUBETAS
MÉTODO:
Primero, tomar una cubeta como referencia y medir la transmitancia de la solución preparada con colorante Rojo Congo. Realizar el mismo procedimiento con la cubeta restante. No debe existir más de 1% de variación entre los valores obtenidos; en caso contrario, corregir como error sistemático.
RESULTADOS:
T% cubeta de referencia: 4,7%
T% cubeta restante: 4,5%
Variación: 0,2%
2- CONTROL DE LUZ ESPÚREA
MÉTODO:
Comenzar colocando la cubeta pintada de negro y medir la transmitancia en cualquier longitud de onda del espectro visible. Si el T% de luz espúrea es mayor del 1%, recurrir al service.
RESULTADOS:
T% cubeta pintada de negro: 0,0%
3- CONTROL DE VOLUMEN MÍNIMO DE LECTURA
MÉTODO:
Cargar la cubeta con 0,5 ml de la solución de colorante de Rojo Congo y leer contra blanco de agua la Abs de la misma. Luego, aumentar el volumen agregando solución coloreada (0,8; 1; 2; 2,5; 3; 3,5 ml). Informar el volumen mínimo como aquel en el que la lectura se estabiliza y no varía con el agregado de más líquido. Realizar un gráfico de Abs= f(vol agregado).
RESULTADOS:
Tabla: Absorbancia en función del volumen dado:
| Vol (ml) | Abs (±0,001) |
| 0,0 | 0,000 |
| 0,5 | 0,040 |
| 0,8 | 0,041 |
| 1,0 | 0,088 |
| 2,0 | 1,231 |
| 2,5 | 1,234 |
| 3,0 | 1,234 |
| 3,5 | 1,233 |
4- CONTROL DE CENTRO DE BANDA
MÉTODO:
En primer lugar, realizar un barrido espectral desde 450 hasta 600 nm, con intervalos de 10 nm, excepto en la franja de 490 - 530 nm donde las lecturas se tomarán cada 5 nm; utilizando la solución de colorante de Rojo Congo.
Determinar el centro de banda, graficando Abs= f(λ) y determinar el λ máximo (λ óptimo de 503 nm) .
RESULTADOS:
Tabla: Absorbancia en función de longitud de onda:
| λ (nm) | Abs (±0.001) | λ (nm) | Abs (±0.001) |
| 450 | 0,678 | 520 | 1,081 |
| 460 | 0,949 | 525 | 1,018 |
| 470 | 1,068 | 530 | 0,939 |
| 480 | 1,176 | 540 | 0,595 |
| 490 | 1,253 | 550 | 0,573 |
| 495 | 1,251 | 560 | 0,441 |
| 500 | 1,231 | 570 | 0,321 |
| 505 | 1,204 | 580 | 0,214 |
| 510 | 1,162 | 590 | 0,116 |
| 515 | 1,140 | 600 | 0,065 |
5- CONTROL DE LINEALIDAD FOTOMÉTRICA
MÉTODO:
La solución de Rojo Congo diluída 1/5 será tomada como la solución madre al 100% (0,060 mg/ml) A partir de ésta hacer diluciones para obtener soluciones al 75; 50; 25 y 12,5% (0,045; 0,03; 0,015 y 0,0075 mg/ml respectivamente). Medir las absorbancias de las soluciones al λ óptimo. Finalmente, graficar Abs = f(Cc), considerando como dato el 0%.
RESULTADOS:
(Se preparó poca cantidad de solución al 100%, por lo tanto para preparar las soluciones al 75; 50; 25 y 12,5%, se midieron 1,5; 1; 0,5 y 0,25 ml de la solución concentrada de Rojo Congo, diluyendo todas a 10 ml con agua)
| Cc (mg/ml) | Abs (± 0.001) |
| 0,0000 | 0,000 |
| 0,0075 | 0,163 |
| 0,0150 | 0,319 |
| 0,0300 | 0,673 |
| 0,0450 | 0,954 |
| 0,0600 | 1,315 |
ESPECTROFOTÓMETRO Baughs Lomb
1- CONTROL DE TUBOS
MÉTODO:
Primero, tomar un tubo como referencia y medir la transmitancia de la solución preparada con colorante Rojo Congo. Realizar el mismo procedimiento con el tubo restante. No debe existir más de 1% de variación entre los valores obtenidos; en caso contrario, corregir como error sistemático.
RESULTADOS:
T% Tubo de referencia: 21%
T% Tubo restante: 21%
Variación: 0%
2- CONTROL DE LUZ ESPÚREA
MÉTODO:
Comenzar colocando el tubo negro y medir la transmitancia en cualquier longitud de onda del espectro visible. Si el T% de luz espúrea es mayor del 1%, recurrir al service.
RESULTADOS:
T% tubo pintada de negro: 0,0%
3- CONTROL DE VOLUMEN MÍNIMO DE LECTURA
MÉTODO:
Cargar el tubo con 0,5 ml de la solución de colorante de Rojo Congo y leer contra blanco de agua la Abs del misma. Luego, aumentar el volumen agregando solución coloreada (0,8; 1; 2; 2,5; 3; 3,5 ml). Informar el volumen mínimo como aquel en el que la lectura se estabiliza y no varía con el agregado de más líquido. Realizar un gráfico de Abs = f(vol agregado).
RESULTADOS:
| Vol (ml) | Trasmit (±1) | Abs |
| 0 | 100 | 0,000 |
| 0,5 | 80 | 0,097 |
| 0,8 | 85 | 0,071 |
| 1,0 | 85 | 0,071 |
| 2,0 | 10 | 1,000 |
| 2,5 | 17 | 0,077 |
| 3,0 | 17 | 0,077 |
| 3,5 | 17 | 0,077 |
5- CONTROL DE LINEALIDAD FOTOMÉTRICA
MÉTODO:
La solución de Rojo Congo diluída 1/5 será tomada como la solución madre al 100% (0,060 mg/ml). A partir de ésta hacer diluciones para obtener soluciones al 75; 50; 25 y 12,5% (0,045; 0,03; 0,015 y 0,0075 mg/ml respectivamente). Medir las absorbancias de las soluciones al λ óptimo. Finalmente, graficar Abs = f(Cc), considerando como dato el 0%.
RESULTADOS:
| Cc (mg/ml) | %T (±1) | Abs |
| 0 | 100 | 0,000 |
| 12,5 | 69 | 0,161 |
| 25 | 47 | 0,328 |
| 50 | 21 | 0,678 |
| 75 | 10 | 1,000 |
| 100 | 4 | 1,398 |
CONCLUSIÓN GENERAL:
La secuencia de trabajo se realizó de esta manera para asegurarnos que el resultado negativo de un control no altere el resultado de los siguientes.
De acuerdo a los resultados obtenidos todos los controles realizados cumplen con los requerimientos establecidos excepto el control de centro de banda que indica un corrimiento de la longitud de onda. Este desperfecto puede corregirse ajustando el tormillo corrector de centro de banda.
En caso de realizarse esta corrección podemos afirmar que el espectrofotómetro Jenway 6300 Nº12 funciona adecuadamente.
En el caso del espectrofotómetro Bauschg Lomb Nº1, basándonos en los resultados podemos confirmar que es un aparato muy confiable. En el caso de volumen mínimo el valor obtenido en los dos mililitros se debido, posiblemente a que el haz de luz dio justamente en el menisco, lo cual produjo una gran dispersión de luz, es decir, muy baja transmitancia. Por falta de tiempo, no pudimos realizar el control de centro de bandas.
Finalmente, podemos concluir que es mejor utilizar el Jenway 6300, ya que es digital, es más sensible, y para realizar los gráficos no debemos pasar de transmitancia a absorbancia.
Anexo cálculos auxiliares:
Cc. solución rojo congo= 300 mg/l = 0,3 mg/ml
Dilución 1/5= 1,0 ml x 0,3 mg/ml / 5,0 ml= 0,06 mg/ml (solución al 100%)
Solución 75%= 1,5 ml x 0,3 mg/ml / 10,0 ml= 0,045 mg/ml
Solución 50%= 1,0 ml x 0,3 mg/ml / 10,0 ml= 0,03 mg/ml
Solución 25%= 0,5 ml x 0,3 mg/ml / 10,0 ml= 0,015 mg/ml
Solución 12,5%= 0,25 ml x 0,3 mg/ml / 10,0 ml= 0,0075 mg/ml
CONTROL DE VOLUMEN MÍNIMO DE LECTURA
Abs = 2 - log %T
Abs = 2 - log 100 = 0
Abs = 2 - log 80 = 0,0969
Abs = 2 - log 85 = 0,0706
Abs = 2 - log 10 = 1
Abs = 2 - log 17 = 0,07696
CONTROL DE LINEALIDAD FOTOMÉTRICA
Abs = 2 - log 100 = 0
Abs = 2 - log 69 = 0,161
Abs = 2 - log 47 = 0,328
Abs = 2 - log 21 = 0,678
Abs = 2 - log 10 = 1
Abs = 2 - log 4 = 1,398